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e-Revue de Génie Industriel
Revue électronique internationale pour la science et la technologie
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Numero 4 (2009)

Article

Evaluation de l’activité antioxydant des composés phénoliques par la réactivité avec le radical libre DPPH


Cristina Popovici, Université technique de Moldova
Ilonka Saykova, Université de technologie chimique et de métallurgie
Bartosz Tylkowski, Université de technologie chimique et de métallurgie

Date de publication : 23 août 2010

Résumé

Ce travail s’inscrit dans le cadre de la valorisation des extraits des pépins de raisin en tant qu’antioxydants. La méthode appliquée pour mesurer une activité antioxydant est celle du piégeage des radicaux libres à l'aide du DPPH• Les facteurs qui influencent la réactivité au radical libre DPPH• et les protocoles publiés ont été discutés. À des fins comparatives sont testées des solutions modèles de composés appartenant à des familles phénoliques distinctes (solutions d’acide gallique, d’épicatéhine, d’acide tannique et de leurs mélanges). Les propriétés antioxydantes ont été mesurées et mises en évidence par la concentration efficace CE50 et par la cinétique de réduction. Les résultats indiquent une variation de CE50 de 30.8-86.6 antioxydant/g DPPH et des temps de réaction TCE50 entre 5 et 30 minutes, corrélés avec leur structure chimique et la teneur en composés phénoliques.

Abstract

This works is inscribed in the frame of valorization of grape seeds extracts as antioxidants. The method applied to measure the antioxidant activity was the free radical scavenging by using DPPH•. The factors that influence DPPH• radical reduction kinetics and the analytical protocols published are discussed. For comparison purposes, model solutions of compounds of distinct phenolic families (single solutions of gallic acid, epicatechin, tannic acid and their mixtures) were tested. The antioxidant proprieties were measured and evidenced in terms of their efficient concentration EC50, as well as their reduction kinetics. The results indicate a variation of EC50 between 30.8-86.6 mg antioxidant/g DPPH• and times of reaction TEC50 from 5 to 30 minutes, in correlation with their chemical structure and the content of phenolic compounds.


Table des matières

Texte intégral

Ces dernières années, l’intérêt porté aux antioxydants naturels, en relation avec leurs propriétés thérapeutiques, a augmenté considérablement. Des recherches scientifiques dans diverses spécialités ont été développées pour l’extraction, l’identification et la quantification de ces composés à partir de plusieurs substances naturelles à savoir, les plantes médicinales et les produits agroalimentaires [1,2,3].

L’activité antioxydante d’un composé correspond à sa capacité à résister à l’oxydation. Les antioxydants les plus connus sont le β-carotène (provitamine A), l’acide ascorbique (vitamine C), le tocophérol (vitamine E) ainsi que les composés phénoliques. En effet, la plupart des antioxydants de synthèse ou d’origine naturelle possèdent des groupes hydroxyphénoliques dans leurs structures et les propriétés antioxydantes sont attribuées en partie à la capacité de ces composés naturels à piéger les radicaux libres tels que les radicaux hydroxyles (OH•) et superoxydes (O2•) [4-7].

Plusieurs méthodes sont utilisées pour évaluer, in vitro et in vivo, l’activité antioxydante par piégeage de radicaux différents, comme les peroxydes ROO• par les méthodes ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity) et TRAP (Total Radical-Trapping Antioxidant Parameter) [8]; les ions ferriques par la méthode FRAP (Ferric ion Reducing Antioxidant Parameter) [9]; ou les radicaux ABTS• (sel d’ammonium de l’acide 2,2’-azinobis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonique) [10], ainsi que la méthode utilisant le radical libre DPPH• (diphényl-picrylhydrazyle) [11].

Compte tenu de la complexité des processus d’oxydation et la nature diversifiée des antioxydants, avec des composants à la fois hydrophiles et hydrophobes, il n’y a pas une méthode universelle par laquelle l’activité antioxydante peut être mesurée quantitativement d’une façon bien précise. Le plus souvent il faut combiner les réponses de tests différents et complémentaires pour avoir une indication sur la capacité antioxydante de l’échantillon à tester [12,13,14].

De point de vue méthodologique, le test au radical libre DPPH• est recommandé pour des composés contenant SH-, NH- et OH- groupes [15]. Il s’effectue à température ambiante, ceci permettant d’éliminer tout risque de dégradation thermique des molécules thermolabiles. Le test est largement utilisé au niveau de l’évolution des extraits hydrophiles en provenance de thé vert, des jus de fruits et de raisins, pépins et pulpes, très riches en composés phénoliques [16-27].

Dans ce cadre, l’étude s’est intéressée à l’évaluation des activités antioxydantes d’extraits de pépins de raisin en vue de leur valorisation en tant qu’antioxydants. Une étude comparative a été réalisée à partir des protocoles analytiques publiés afin d’évaluer l’effet des facteurs qui influent sur la méthode de mesure de la capacité anti-radicalaire à l’aide du DPPH•. Comme exemple d’illustration les cinétiques de réduction du DPPH• réagissant avec l’acide gallique, l’épicatéchine et l’acide tannique ont été étudiées afin d’estimer la différence d’efficacité entre différentes familles de composés phénoliques  présents dans les pépins de raisins.

L’objectif de l’étude est de proposer une technique rapide et reproductible permettant de comparer les extraits vis-à-vis de leur action sur les phénomènes du piégage des radicaux libres. Cette classification permettra de choisir les conditions les plus adéquates lors des différentes étapes de la valorisation de la matière première: extraction, purification et concentration en fonction d’un critère de qualité optimal : d’une part la teneur en composés phénoliques et parallèlement, leur activité anti-radicalaire.

Le composé chimique 2,2-diphényl-1-picrylhydrazyle (α,α-diphényl-β-picrylhydrazylе) fut l’un des premiers radicaux libres utilisé pour étudier la relation structure-activité antioxydant des composés phénoliques [28,29]. Il possède un électron non apparié sur un atome du pont d’azote (Fig.1). Du fait de cette délocalisation, les molécules du radical ne forment pas des dimères, i.e. DPPH• reste dans sa forme monomère relativement stable à température ordinaire. La délocalisation provoque aussi la couleur bleue bien caractéristique de la solution de DPPH•. La mesure de l’efficacité d’un antioxydant se fait en mesurant la diminution de la coloration bleue, due à une recombinaison des radicaux DPPH•, mesurable par spectrophotométrie à 515-518 nm.

Image1

Figure 1. Structure chimique du radical libre DPPH• (2,2 DiPhenyle-1-Pikryl-Hydrazyle)

Le piégeage des radicaux libres par des antioxydants est tributaire de deux types de mécanismes: (i) la libération de l’atome d’hydrogène du groupement hydroxyle (cinétique rapide de certaines acides et dérivées phénoliques); (ii) la libération d’un électron (cinétique lente des dérivées glycosylées et des anthocyanes) [3,18].

Dans le cas des composés phénoliques (Φ-OH), le mécanisme principal d’action est le piégeage des radicaux libres par le transfert de l’atome H sur le DPPH• alors transformé en une molécule stable DPPHH [30,31] :

DPPH•+ ΦOH DPPHH + ΦO•

Plusieurs voies réactionnelles sont alors possibles qui forment des structures plus au moins stables :

ΦO•+ ΦO• ΦO-OΦ

DPPH•+ ΦO• ΦO-DPPH

ΦO• (semi-quinone)- H• Φ=O (quinone)

La capacité anti-radicalaire (capacité à fixer des radicaux libres, donc à arrêter la propagation de la réaction en chaîne) ne peut être mesurée directement, mais par contrôle de l’effet de la réactivité. Plusieurs facteurs influent sur le potentiel antioxydant et la cinétique de réduction, notamment les conditions de la réaction (temps, rapport Antioxydant/DPPH•, type de solvants, pH) et le profil phénolique en particulier [30].

Pour l’évaluation de l’activité antioxydante, deux approches sont appliquées: d’une part, la détermination de la réduction relative du radical DPPH• à un temps de référence ou la détermination de la quantité d’antioxydant nécessaire pour réduire 50 % de DPPH• et d’autre part, le suivi de la cinétique de la réduction [31,32].

Dans la première approche, l’activité est définie par l’indice de la réduction de l’activité anti-radicalaire en pourcentage %RSA (Radical Scavenger Activity), où l’absorbance du mélange réactionnel qui contient le radical libre et l’échantillon de l’antioxydant est reliée avec l’absorbance du mélange sans aucun antioxydant (solution témoin ou contrôle) à un temps t : [%RSA=(Abscontrôle – Abst)/ Abscontrôle x 100%].

Comme il n’existe pas de mesure absolue de la capacité antioxydante d’un composé, les résultats sont souvent portés par rapport à un antioxydant de référence, comme  l’acide ascorbique (vitamine C), les antioxydants synthétiques BHT (butyl-hydroxy-toluène) ou le Trolox® (acide-6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylique), dont la structure moléculaire cyclique est similaire à celle de la vitamine E [30].

L’indice relative %RSA montre seulement la capacité de l’échantillon, à une concentration fixée, de réduire ou non les radicaux et dans beaucoup de cas, l’augmentation de la concentration de l’antioxydant amène l’augmentation de ces indices relatifs [31].

Pour s’affranchir de l’influence de la concentration, dans la majorité des études, la réactivité est estimée par la concentration effective CE50 (ou l’inverse 1/CE50) de l’antioxydant, qui correspond à une réduction de 50% de l’activité (de l’absorbance) du DPPH• dans le milieu réactionnel. La capacité antioxydante d'un composé est d'autant plus élevée que sa CE50 est petite. L’indice CE50 montre les concentrations de l’antioxydant qui sont nécessaires pour faire décroître la concentration initiale du DPPH• avec 50% (exprimée en mol Antioxydant/mol DPPH• ou mg Antioxydant/g DPPH•), mais ne prennent pas en considération l’influence de la concentration sur le temps de la réaction [31].

Pour mieux caractériser le pouvoir anti-radicalaire, dans la deuxième approche des paramètres cinétiques sont introduits, tels que le temps TEC50 nécessaire pour atteindre l’équilibre à CE50, la constante de vitesse de la réaction ou le coefficient directeur de la courbe cinétique [32,33,34]. L’estimation de TCE50 permet d’introduire la classification suivante: TCE50 < 5 min (réaction rapide), 5-30 min (réaction intermédiaire) et TCE50 > 30 min (réaction lente) [29,32]. L’indice de l’efficacité anti-radicalaire [EAR =1/(CE50.TCE50)] relie la concentration du DPPH• et le temps TEC50 dans l’essai avec la concentration effective CE50 de l’échantillon, et résulte dans un paramètre constant pour chaque solution ou extrait.

Une étude comparative des protocoles analytiques publiés a été réalisée, focalisée sur l’évaluation des extraits issus des pépins de raisin (Tableau 1). Il est à noter que les pépins de raisin présentent de très fortes teneurs en composés phénoliques, qui peuvent se regrouper de la sorte: (i) les composés non-flavonoïdes dont font partie les acides phénoliques (ex. acide gallique); (ii) les flavonoïdes qui comprennent les flavonols, les anthocyanes responsables de la couleur et les flavan-3-ols dont les molécules de catéchine et de l’épicatéchine et leurs dérivées glycosylées sont très abondantes ; (iii) les tannins condensés avec un degré de polymérisation faible, inférieur à 3 (procyanidines dimères et trimères et leurs esters galliques) [24].

Bien que l’extraction à partir des pépins de raisin soit extrêmement étudiée, il est relativement difficile de comparer les données de la littérature (Tableau 1). En effet, il existe une diversité des variétés, maturité, conditions climatiques et conditions de stockage des raisin et de leur déchets, d’une part et une assez grande variation dans les procédés d’extraction d’autre part : type de solvants (eau, éthanol, méthanol, acétone, éthyle acétate), température (20-60°C) et temps d’extraction (de 5 minutes à 24 heures).

Les tests au DPPH• fournis dans la littérature sont basés sur le même principe que celui décrit par Brand-Williams et al. [29], mais les protocoles analytiques diffèrent dans plusieurs paramètres. Dans la méthode originale des solutions de DPPH• à 50-100 µM (les absorbances à 515 nm autour de 1) et un temps de réaction de 30 minutes ont été recommandés, et ces conditions sont utilisées dans plusieurs travaux récents [14,23,25,38,39]. En même temps, des solutions de DPPH• variant de 25 à 600 µM (faites le plus souvent avec du méthanol ou éthanol) et des temps de réaction plus courts (5, 10 et 20 min) ou plus longs (60 min, 100 min et 120 min) sont également rapportés [24,35-38].

Toutefois il est important de noter que l’utilisation de différents protocoles de mesure et de différents indices d’évaluation de l’activité antioxydante réduit la fiabilité d’une comparaison des valeurs.

Tableau 1. Synthèse de l’étude bibliographique sur l’activité anti-radicalaire d’extraits de pépins de raisin.

Conditions du test au DPPH•

TCP*

Conditions d’extraction

Indice d’évaluation de l’activité anti-radicalaire

Ref.

VAO /VDPPH• (25 µM dans MeOH)

=1 ml/2 ml; t=5 min; λ=517 nm

6.71-7.04

(EtAc:Ac:Eau, 60°C, 8h)

% RSA=90.2-92.6%

(des extraits de 25, 50 et 100 µg /ml)

[35]

VAO /VDPPH• (60 µM dans MeOH) =0.1ml/4 ml; t=30 min ; λ=517 nm

7.5-40.4

(70%EtOH, 70%Ac, MeOH, H2O, 45°C, 2h)

CE50=3.35-11.8 mg/ml

[14]

VAO /VDPPH• (120 µM dans MeOH) =0.1ml/3.9 ml; t=Teq; λ=515 nm

50.3-87.1

(70% EtOH acidifié, Tamb, 4h)

CE50=1.74-3.49 µg GAE/ml

[24]

VAO /VDPPH• (63 µM dans MeOH) =0.1ml/3.9 ml; t= Teq; λ=515 nm

79.2-154.6

(Ac 70%, 50°C, 2h)

CE50=2.71-4.62 µg/ml

[25]

VAO /VDPPH• (500 µM dans EtOH) =0.2ml/3 ml; t=15 min; λ=517 nm

12-20 (moyen de 9 variétés)

(EtOH, 50-90°C, 1-12 h)

CE50=22.9-32.90 µg /ml

[36]

VAO /VDPPH• (600 µM dans EtOH) =0.025ml/0.975 ml;

t=120 min; λ=515 nm

1.43-22.28 (9 variétés)

(EtOAc, Tamb, 5 min)

CE50=0.24-0.92 g GAE /µg DPPH•

[37]

VAO /VDPPH• (63 µM dans MeOH) =0.025ml/0.975 ml

t=120 min; λ=515 nm

171.45 (moyen de 24 variétés)

 (H20, Tamb, 4 h)

CE50=0.66 µg /µg DPPH•

[38]

VAO /VDPPH• (73 µM dans MeOH) =0.025ml/0.975 ml

t=30 min; λ=515 nm

79.57-137.56

(EtAc:Ac:H20, Tamb, 10min + macération)

AAR=4.57-8.85 mM TRE/g MS

[23]

VAO /VDPPH• (60 µM dans MeOH) =0.025ml/0.975 ml;

t=30 min; λ=515 nm

3.6-54.9 (moyen de 9 variétés)

(MeOH acidifié, Tamb,

12 h)

AAR=16.8-92.2 mM TRE/g MS

[39]

*Teneur en Composés Phénoliques, (mg Antioxydant/g matière sèche)

À titre d’exemple nous avons évalué la capacité antioxydante de produits classiques, représentatifs du profil phénolique des pépins de raisin [40]. Trois composés phénoliques aux propriétés différentes sont testés: acide gallique AG (Mw=170.1 g mol- 1), épicatéchine EC (Mw=290.3 g mol-1) et acide tannique AT (Mw=1700.1g mol- 1).

L’acide gallique est présent dans les pépins de raisin sous sa forme libre et surtout faisant partie d’une molécule phénolique (Fig.2). L’épicatéchine, un stéréo-isomère de la catéchine, appartient à la classe des flavan-3-ols. Ils possèdent tous une même structure de base à quinze atomes de carbone, constituée de deux cycles aromatiques (A et B) en C6, reliés par un hétérocycle (C) en C3 (Fig. 2). Le deuxième cycle (B) se lie à l’hétérocycle en position 2 ou 3. A l’état naturel, un ou plusieurs de leurs groupements hydroxyles sont glycosylés. Ainsi, on retrouve les flavanols communs avec une configuration -cis dans les positions 2,3 : épicatéchine, épigallocatéchine, épicatéchine gallate, épigallocatéchine gallate, et avec une configuration -trans dans les positions 2,3 : catéchine, gallocatéchine, gallocatéchine gallate.

L’acide tannique est un mélange complexe de gallotanins qui sont des esters de l’acide gallique ou/et de ses dimères d’acide digallique et d’acide ellagique avec des monosaccharides, essentiellement la glucose. Il faut noter que la structure de l’acide tannique n’est pas bien établie et elle peut contenir un nombre différent de groupements gallyol glycosylés. Néanmoins, une structure de base (C76H52O46) similaire à sa masse molaire est présentée sur la Fig.2.

Image2

Figure 2. Structure chimique des composés phénoliques testés.

La solution de DPPH• à 63.4 µM (25 mg dans 100 ml de méthanol 90%) est préparée à l’avance (au moins 1-2 heures) car la solubilisation est difficile, et elle ne se conserve pas plus de 4-5 jours à -5°C et à l’obscurité. Chaque composé phénolique a été dissous dans une solution de 70% éthanol-30% eau distillée. Des volumes de 0.1 ml de la solution à tester ont été mélangés avec la solution du DPPH• (3.9 ml; absorbance de 0.68 ± 0.03 à 515 nm). Le mélange réactionnel est agité vigoureusement pendant 10 secondes. Le contenu est ensuite transféré dans un micro-tube de 4 ml, puis incubé dans la cavité du spectrophotomètre pendant le temps nécessaire pour atteindre le plateau avec ce type d’échantillon. A des intervalles de temps réguliers, les absorbances à 515 nm ont été enregistrées (contre le méthanol) sur un spectrophotomètre UV-VIS Bueco S-22.

Les écart-types ont été calculés à partir de trois séries d’expériences. Une erreur moyenne de ±3% sur les concentrations restant à l’équilibre [DPPH•]eq a été obtenue. Par contre, une incertitude de reproductibilité sur le temps à atteindre l’équilibre Teq et les absorbances dans les premières secondes de la réaction a été détectée (dispersion supérieure à ±10%)

Dans un premier temps, la stabilité et l’intervalle de linéarité des solutions du DPPH• ont été évalués et les résultats sont présentés sur la Fig.3. Cinq solutions du DPPH• faites dans du méthanol dans l’intervalle 3.37-63.4 µM (15-250 µg/ml) ont été testées.

Image3

Figure 3. La courbe de calibration du DPPH•.

Il n’y a pas de différence significative dans l’absorbance entre 0 et 90 min pour les concentrations testées et une bonne linéarité concentration - absorbance a été observée. Ce résultat est confirmé dans des études précédentes qui ont rapporté que l’absorbance du DPPH• à 515 nm dans du méthanol a diminué avec 20% pour 120 min à 25°C et sous l’action de la lumière, pourtant, à l’obscurité, il n’a pas été observé un changement significatif pendant 150 min [41].

La cinétique de réduction du DPPH• à différentes concentrations en antioxydant testé est suivie au cours du temps jusqu’à l’obtention d’un plateau au temps final (Teq). La réduction des radicaux libres est évaluée par le rapport relatif de la concentration résiduelle [DPPH•]t=Teq restant en fin de cinétique par rapport à sa concentration initiale:

Image4

L’indice %(DPPH•)R diminue jusqu’à atteindre un plateau, cette cinétique variant selon l’antioxydant utilisé (Tableau 2).

Tableau 2. Test d’activité anti-radicalaire au DPPH•

Image5

Les profils cinétiques obtenus révèlent une activité anti-radicalaire fortement dépendante des rapports molaires Rm=[Antioxydant]/[DPPH•]. Plus le composé antioxydant est concentré, plus la baisse de l’absorbance est importante. Les Figures 4 et 5 illustrent cet effet dans le cas de l’acide gallique pour la variation de la concentration entre 0.01875-0.15 mg/ml (rapports molaires Rm=0.0474-0.3675 mol AG/mol DPPH•).

Image6

Figure 4. Effet des rapports molaires Rm=[acide gallique]/[DPPH•] sur la cinétique de réduction.

Pour un Rm=0.3675 mol AG/mol DPPH• dans le mélange réactionnel, le radical est presque totalement consommé. Le temps nécessaire pour atteindre l’équilibre Teq varie en fonction des concentrations entre 3 minutes (réaction très rapide) et 10-30 minutes (réactions intermédiaires). A partir de la courbe traçant la relation entre le pourcentage de réduction %(DPPH•)R et la teneur en composé phénolique on en déduit par interpolation graphique la concentration CE50 et le temps TCE50. La courbe est linéaire à faibles concentrations et logarithmique à concentrations élevées (Fig.5). La concentration efficace CE50 dans le cas de l’acide gallique est atteinte pour Rm=0.1 mol AG/mol DPPH• (43.8 mg AG/g DPPH•).

En considérant le pouvoir anti-radicalaire (1/CE50) et le temps de la réaction TCE50 pour atteindre 50% réduction, l’indice de l’efficacité anti-radicalaire EAR a été calculé [32]:

Image7

Les solutions testées ont été classées suivant la classification proposée par Sanchez-Moreno et all. [32] : l’activité anti-radicalaire est faible pour EAR<1.10-3, intermédiaire entre 1.10-3-5.10-3, élevée entre 5.10-3-10.10-3, et très élevée pour EAR>10.10-3.

Image8

Figure 5. Détermination de la concentration efficace CE50 en cas de l’acide gallique.

Les paramètres caractéristiques de la cinétique de réduction du DPPH• pour les trois composés testés sont présentés dans le Tableau 3. Parmi les trois composés, l’acide gallique représente le composé le plus actif, le pouvoir antioxydant de l’épicatéchine n’est pas significativement différent et l’acide tannique a donné les valeurs environ 5 fois plus faibles. On obtient ainsi l’ordre décroissant de l’activité antioxydante suivant l’indice EAR : acide gallique > épicatéchine > acide tannique.

Tableau 3. Paramètres caractéristiques de la cinétique de réduction du DPPH•

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Les résultats obtenus sont similaires à ceux obtenus par Sanchez-Moreno et son équipe : l’acide gallique s’est révélé avoir une activité anti-radicalaire intermédiaire (CE50=26 mg AO/g DPPH•, TCE50=14.69 min et EAR=2.62x10-3) et l’acide tannique - une activité faible (CE50=59 mg AO/g DPPH•, TCE50=29.55 min et EAR=0.57x10-3) [32]. Dans l’étude citée, c’est l’acide ascorbique qui a affiché une activité anti-radiculaire très élevée du fait du temps de réaction très court (CE50=76 mg AO/g DPPH•, TCE50=1.15 min et EAR=11.44x10-3) [32].

L’étude confirme également une certaine corrélation entre la teneur en composés phénoliques et l’activité anti-radicalaire, mise en évidence dans un grand nombre de travaux [14,22,23,25,35,36]. Des études sur la relation entre la structure chimique des composés phénoliques et leur pouvoir piégeur des radicaux libres ont montré que l’activité anti-radicalaire est dépendante du nombre, de la position et de la nature des substituants sur les cycles B et C (groupements hydroxyles, metaxylés, glycosylés) et le degré de polymérisation [12,18,42,43].

Ces mêmes paramètres sont liés également à la polarité des composés. L’activité plus élevée de l’acide gallique (groupement 3,4,5-tri-OH sur le cycle aromatique) peut être attribuée à sa plus forte polarité (log P=0.06) par rapport aux flavaloïdes (log P=0.8) [27,42].

L’épicatéchine, caractérisée par la présence du groupe 3-OH en combinaison avec la double liaison en position C2-C3, est considérée également comme un antioxydant fort [43,44]. En comparant la capacité à piéger les radicaux libres du DPPH• par les catéchines, Nanjo et collaborateurs ont montré que la capacité de piégeage des catéchines ne dépend pas de leur stéréo-isomérie, mais les dérivés galloylés de catéchines sont des piégeurs plus puissants que les non-galloylés dans l’ordre: gallocatéchine gallate > épigallocatéchine gallate > épicatéchine gallate > épicatéchine = catéchine [12,18]. Il y a une information contradictoire à propos du degré jusqu’au quel la polymérisation a un effet positif sur l’activité anti-radicalaire. Des résultats comparatifs montrent que l’activité antioxydante croît à un degré de polymérisation faible, inférieur à 3 (Oligomeric Polyphenols Compounds OPC) [24].

Une série de tests a été effectuée pour évaluer les interactions possibles entre les antioxydants. Différentes combinaisons de composés phénoliques AG:EC, AG:AT et AG:EC:AT à des concentrations différentes ont été testées afin de couvrir la plage de la réduction de DHHP•. Chacun de ces composés, en fonction de ses différentes propriétés, contribue à l’activité antioxydante des extraits suite à des interactions plus au moins complexes.

Image10

Figure 6. Cinétique de réduction de [DPPH•] 63.4 µM avec l’acide gallique, l’épicatéhine, l’acide tannique et leurs mélanges.

AG (0.1 mg/ml) ; EC (0.5 mg/ml) ; TA (0.5 mg/ml) ; AG:EC (0.1:0.5 mg/ml) ; AG:AT (0.1: 0.5 mg/ml) ; AG:EC:AT (0.1:0.5:0.5 mg/ml).

Des profils très identiques sont observés à des concentrations élevées, quel que soit le type de composés étudié : plateau atteint vers 6-8 %DPPH• pour 10 min maximum (Fig. 6). On peut conclure que l’activité antioxydante augmentera avec la teneur en composés phénoliques, jusqu'à atteindre un plateau.

Par contre, il y a des différences significatives dans les cinétiques de réduction dans le cas des solutions à plus faibles concentrations provoquant une réduction partielle de DPPH• (Fig.7).

Image11

Figure 7. Effet de mélange des composés purs: acide gallique, épicatéchine et acide tannique

AG (0.05 mg/ml) ; EC (0.25 mg/ml), AT (0.05 mg/ml) ; AG:EC (0.05:0.25 mg/ml) ; AG:AT (0.05:0.05 mg/ml) ; AG:EC:AT (0.05:0.25:0.05 mg/ml)

Les mélanges présentent une activité anti-oxydante nettement supérieure à celle des composés purs EC ou AT, mais inférieure à l’AG. De même, l’instabilité de l’acide tannique après 15 minutes est établie par une augmentation de l’absorbance, très marquée en cas du mélange ternaire AG:EC:AT. Il existe donc des différences qualitatives dans la nature de ces composés phénoliques, d’une part, et probablement, des réactions de décomposion et d’interaction induisant un effet pro-oxydant (antagoniste) à celui du piégeage des radicaux libres d’autre part.

Bien que le test au DPPH• soit considéré comme une méthode simple, rapide et facile à mettre en œuvre, les expériences ont montré certaines difficultés de la mesure de l’état de réduction: un phénomène dynamique à fable concentration (traces d’antioxydant en ppm) et accompagné de nombreux composés formés, dans certains cas instables.

De plus, il existe une hétérogénéité structurale au sein des composés phénoliques, hétérogénéité qui se traduit par des propriétés différentes. C’est pourquoi, en effectuant des tests de mesure de la cinétique de l’activité anti-radicalaire, on peut générer une évaluation plus globale des propriétés des échantillons étudiés. L’estimation simultanée du pouvoir anti-radicalaire 1/CE50 et du temps de réaction TCE50 permettent d’estimer d’une meilleure façon l’activité antioxydante  par l’indice de l’efficacité anti-radicalaire.

Le test au DPPH• n’est pas quantitatif, il permet de comparer différents extraits entre eux selon leur capacité à piéger le DPPH• et ainsi, d’apprécier les variations qualitatives des composés phénoliques. L’évaluation de l’activité anti-radicalaire doit être interprétée avec précaution du fait que l’absorbance du DPPH• à 515-520 nm diminue sous l’action de la lumière, de l’oxygène, en fonction du pH et le type du solvant additionné à l’antioxydant.

La structure chimique et la polarité de l’antioxydant sont déterminantes pour sa capacité à piéger les radicaux libres. Des effets synergiques mais aussi antagonistes ont été observés dans des solutions modèles qui contiennent plusieurs composés fonctionnels à activité anti-radicalaire. Néanmoins, ces observations sont basées sur une simple estimation des activités des composés purs, et des études plus poussées seraient à mener avec des extraits réels.

Remerciements : Ce travail a été effectué grâce à l’appui financier de l’AUF dans le cadre du projet Pôle d’excellence régional: Centre Interdisciplinaire de Formation et de Recherche "Sciences et Techniques" (CIFR SciTech) et en coopération avec le Fonds «Science» à UTCM-Sofia, dans le cadre du contrat 10163/09.



Liste des références bibliographiques

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Liens

Pour citer cet article


Popovici Cristina, Saykova Ilonka et Tylkowski Bartosz. Evaluation de l’activité antioxydant des composés phénoliques par la réactivité avec le radical libre DPPH. e-Revue de génie industriel [en ligne], Numero 4 (2009), 23 août 2010. Disponible sur Internet : http://www.revue-genie-industriel.info/document.php?id=951. ISSN 1313-8871.




 
Revue électronique internationale publiée par l'Universite de technologie chimique et de métallurgie (Sofia, Bulgarie) en partenariat avec l'Universite technique de Moldova (Chisinau, Moldava) et l'Universite Babes-Bolyai (Cluj-Napoca, Roumanie) avec le soutien de l'Agence universitaire de la Francophonie (AUF)